Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) — молекулярно-биологический метод, позволяющий определять взаимодействия (пространственную близость) участков хроматина, расположенных на значительном удалении друг от друга в геноме.[1] Такие взаимодействия представляют интерес для определения регуляторных элементов. Регуляторные элементы в клетках могут находиться на значительном расстоянии от промотора регулируемого гена (например, цис-регуляторные элементы, транс-регуляторные элементы, инсуляторы, энхансеры). Для понимания механизмов таких взаимодействий необходимо знать пространственное расположение участков хроматина друг относительно друга, что этот метод и позволяет определить de novo. В свою очередь, полученная информация важна для понимания механизмов регуляции экспрессии генов.[2]
ChIA-PET основан на применении ChIР, 3С (Определение конформации хромосом) и секвенировании спаренных концов(англ. Paired-end tag), для чего используется высокопроизводительное секвенирование и дальнейшая компьютерная обработка результатов.[3]
Метод впервые был использован в 2009 году[1] для определения удаленных сайтов связывания ER-alpha при раке молочной железы у человека. Впоследствии был использован, например, для построения интерактома (карты возможных взаимодействий), опосредованного CTCF в эмбриональных стволовых клетках мыши[4].
ChIA-PET комбинирует возможности методов, основанных на ChIP и 3C[5], расширяя возможности каждого из них. Традиционный метод ChIP позволяет определить взаимодействие определенного белка с ДНК и может использоваться для поиска сайтов связывания транскрипционных факторов. При использовании ChIP-seq могут быть определены участки связывания интересующего белка de novo в целом геноме. Если белок связывает участки хроматина, находящиеся далеко друг от друга на хромосоме, но близко в пространстве, ChIP-seq может определить каждый из них, но не укажет на их взаимодействие. При этом не все последовательности, определенные методом ChIP-seq, уникально картируются в геноме и не все являются функциональными сайтами связывания[6].
В основе методов 3C и ChIA-PET лежит теория проксимального лигирования (англ. proximity ligation), гласящая, что концы участков хроматина, связанных с белковым комплексом, находящиеся рядом, будут лигироваться друг на друга с большей вероятностью, чем концы участков, находящихся в растворе или связанных с другим белковым комплексом.
Метод 3C позволяет определить пространственную структуру хроматина, но не позволяет определить взаимодействующий белок[5]. Существенной проблемой является и необходимость точного знания последовательности взаимодействующих локусов. Это нужно для подбора праймеров для количественного или полуколичественного ПЦР-анализа, используемого для их определения. (Надо заметить, что локусов — кандидатов на взаимодействия — определяемых методом 3C , может быть несколько). Метод ChIA-PET позволяет de novo определять пространственную структуру хроматина, связанного со специфическим белком. То есть, с одной стороны, не требует знания последовательности ДНК в районе взаимодействия, и, с другой полностью зависит от специфичности используемых антител.
ChIР | ChIP-seq | ChIA-PET | 3C | |
---|---|---|---|---|
Необходимо иметь специфические антитела | ||||
Необходимо знать последовательность ДНК в исследуемом локусе | ||||
Необходимо иметь референсный геном | ||||
Метод дает информацию о | Сайтах связывания | О сайтах связывания de novo | О сайтах связывания de novo+ конформация хроматина | Конформации хроматина |
Комплексы ДНК-белок неспецифически сшиваются с помощью формальдегида. Образец подвергается воздействию ультразвука, при этом молекулы ДНК дробятся на фрагменты и разрушаются непрочно связавшиеся неспецифические комплексы. В результате получаются фрагменты ДНК в прочных комплексах с белками. Далее с помощью специфических антител, закрепленных на магнитных шариках, преципитируются фрагменты хроматина, связанные с интересующим белком. Часто объектами исследования являются известные транскрипционные факторы[1]. Преципитированные комплексы извлекаются из раствора за магнитные шарики при помощи магнита. Выделенные комплексы разделяются на 2 аликвоты и на концы молекул ДНК «пришиваются» олигонуклеотидные полулинкеры с известной последовательностью. В одной аликвоте — полулинкер А, в другой — полулинкер В. Оба полулинкера содержат сайт, узнаваемый рестриктазой MmeI, и отличаются друг от друга «баркодом» (barcode) из двух нуклеотидов: CG для полулинкера А, и AT для полулинкера В. В результате в дальнейшем при секвенировании можно отличить линкеры друг от друга по «баркоду». На следующем этапе две аликвоты объединяются и происходит проксимальное лигирование, в результате которого полулинкеры лигируются друг на друга с образованием линкеров полной длины. Линкеры с АА (CG/CG) или BB (AT/AT) «баркодами» считаются вероятными продуктами лигирования внутри одного комплекса, в то время как линкеры с АВ (CG/AT) «баркодами» считаются химерными продуктами лигирования ДНК, связанной с разными белковыми комплексами Подготовка к сиквенсу включает в себя обработку комплексов рестриктазой MmeI[8], которая расщепляет ДНК на определенном расстоянии от своего сайта узнавания в полулинкере. В результате в конце этого этапа получаются конструкции, содержащие пару «тагов» (англ. tag) (по 20 п.н. каждый) с двух сторон от полного линкера (38 п.н.). Полученные фрагменты секвенируют с обоих концов(англ. PET). После этого «таги» картируются на геном.[7][9]
Компьютерная обработка результатов секвенирования включает в себя 6 модулей[7][10]
Все прочитанные последовательности разделяются на последовательности, имеющие читаемые «баркоды» и нечитаемые «баркоды». Если «баркод» не может быть прочитан, то последовательность «отбрасывается» из обработки. Если «баркод» может быть прочитан, то последовательности выравниваются по линкерам. Все полученные последовательности разделяются на химерные (образованные при лигировании ДНК из разных комплексов и содержащие линкер А/В) и нехимерные (содержащие линкер А/А или В/В). Надо заметить, что среди последовательностей, содержащих А/А или В/В также могут встречаться химерные. Далее последовательности собственно линкеров «отбрасываются» и анализируются последовательности «тагов» (РЕТs).[7][10]
Полученные на предыдущем этапе последовательности картируются в референсном геноме. На первом этапе выделяются последовательности, выравнивающиеся на 100 %, которые могут картироваться в одном локусе (уникальные) или во многих локусах. Из оставшихся последовательностей выделяют те, которые содержат 1 замену в последовательности (англ. missmatch) с референсным геномом, они также делятся на уникальные и последовательности с множественным картированием. Все остальные последовательности относятся к некартируемым. Все последовательности кроме уникально картируемых «отбразываются» из обработки.[7][10]
Выделяют две группы РЕТs: "самолигированные" (англ. self-ligation PETs) и "интерлигированные" (англ. inter-ligation PETs). "Самолигированные" (англ. self-ligation PETs) соответствуют концам одного СhIP-фрагмента ДНК, они должны располагаться на одной хромосоме на небольшом расстоянии друг от друга, в ориентации «голова к хвосту». "Интерлигированные" (англ. inter-ligation PETs) делятся на интрахромосомные (картируются на одной хромосоме на большом расстоянии), интерхромосомные (картируются на разных хромосомах) и лигированные в разной ориентации таги (англ. different orientation ligation PETs) (картируются на одной хромосоме на небольшом расстоянии, но в неправильной ориентации или на разных цепях ДНК). Граница, отделяющая "самолигированные" PETs от "интерлигированных" PETs, естественно определяется длиной фрагментов ДНК, получаемых при данной интенсивности «озвучивания». В разных экспериментах она составляла 3 — 4,6 Кb.[7][10]
Для определения сайтов связывания белков используются "самолигированные" таги (англ. self-ligation PETs). Процедура проводится аналогично применяемой в ChIP-seq.
В предсказании этого вида взаимодействий используются "интерлигированные" (англ. inter-ligation PETs).
Данные из предыдущих этапов заносятся в базы данных для хранения, обработки и возможной визуализации.
В ChIA-PET экспериментах используют следующие компьютерные программы
Данная страница на сайте WikiSort.ru содержит текст со страницы сайта "Википедия".
Если Вы хотите её отредактировать, то можете сделать это на странице редактирования в Википедии.
Если сделанные Вами правки не будут кем-нибудь удалены, то через несколько дней они появятся на сайте WikiSort.ru .