WikiSort.ru - Не сортированное

ПОИСК ПО САЙТУ | о проекте

Количественный анализ нуклеиновых кислот — определение концентрации ДНК или РНК в смеси или чистом препарате. Реакции с участием нуклеиновых кислот часто требуют точных сведений о количестве и чистоте препарата. Для определения концентрации нуклеиновой кислоты в растворе используют спектрофотометрический метод и УФ-флюоресценцию, если нуклеиновая кислота содержит краситель.

Спектрофотометрический анализ

Нуклеиновые кислоты определенным образом поглощают ультрафиолет. В спектрофотометрах образец подвергается действию ультрафиолета с длиной волны 260 нм, а фотодетектор измеряет количество света, прошедшего через образец. Чем больше света поглощено, тем выше концентрация нуклеиновой кислоты в образце.

При помощи закона Бугера — Ламберта — Бера возможно соотнести концентрация молекул, поглощающих излучение с количеством поглощенного света. На длине волны 260 нм средний коэффициент экстинкции для двуцепочечной ДНК составляет 0,020 (мкг/мл)−1 см−1, для одноцепочечной ДНК 0,027 (мкг/мл)−1 см−1, для одноцепочечной РНК 0,025 (мкг/мл)−1 cm−1 и для коротких одноцепочечных олигонуклеотидов коэффициент экстинкции зависит от длины и соотношения азотистых оснований (около 0,030 (мкг/мл)−1 cm−1). Отсюда, оптическая плотность (англ. OD, optical density) равная 1 соответствует концентрации двуцепочечной ДНК около 50 мкг/мл. Спектрофотометрический способ определения концентрации нуклеиновых кислот применяет при концентрациях до 2 OD.[1] Более точные коэффициенты экстинкции требуются для определения концентрации олигонуклеотидов, и могут быть предсказаны при помощи модели ближайшего соседства.[2]

Коэффициенты пересчета

Тип нуклеиновой кислотыКонцентрация (мкг/мл) для 1 единицы A260
dsDNA (двуцепочечная ДНК)50
ssDNA (одноцепочечная ДНК)37
ssRNA (одноцепочечная РНК)40

Кюветы для анализа

Для определения концентрации образца, оптическую плотность, определённую при помощи стандартной кюветы с величиной оптического пути 10 мм, необходимо умножить на соответствующий коэффициент. Например, величина поглощения 0,9 оптических единицы двуцепочечной ДНК соответствует концентрации 45 мкг/мл.

Кюветы малого объема

Для многих биологических исследований требуется (ДНК-микрочип, количественная ПЦР) качественное и количественное определение малых объемов нуклеиновых кислот. Специальные нанофотометры[3] позволяют определять концентрации образцов без помощи кюветы в субмикролитровых объемах, начиная от 0,3 мкл. Так как производятся измерения неразбавленного образца, воспроизводимость результатов очень высокая, а сами образцы могут быть использованы после анализа.

Чистота образца

Часто образцы нуклеиновых кислот содержат примеси белков и других органических веществ. Отношение поглощения на длинах волн 260 и 280 нм (A260/280) часто используют для оценки чистоты препарата. Чистая ДНК имеет соотношение A260/280 порядка 1,8, образец РНК без примесей A260/230 около 2.

Примеси белков и отношение 260:280

Для выявления примесей белков в растворах нуклеиновых кислот, анализируют соотношение поглощения растворов на длинах волн 260 и 280 нм, ароматические аминокислоты в составе белков поглощают на 280 нм.[1][4] Однако вклад примесей белков в определение концентрации нуклеиновых кислот небольшой — для того, чтобы повлиять на соотношение 260:280 в растворе нуклеиновой кислоты, концентрация белка должна быть значительной.[1][5]

Отношение 260:280 позволяет определить примесь нуклеиновых кислот в растворах белков и примесей белков в растворах нуклеиновых кислот:

% белка% нуклеиновой кислотыотношение 260:280
10000,57
9551,06
90101,32
70301,73

В случае определения примеси белка в растворе нуклеиновой кислоты отношение 260:230 имеет меньшую чувствительность :

% нуклеиновой кислоты% белкаотношение 260:230
10002,00
9551,99
90101,98
70301,94

Такие отличия обусловлены более высоким значением коэффициента молярной экстинкции в случае нуклеиновых кислот на длинах волн 260 и 280 нм, в сравнении с белками. Поэтому даже для раствора белка относительно высокой концентрации вклад в поглощение на длинах волн 260 и 280 нм небольшой. Определение белкового загрязнения в растворе нуклеиновой кислоты не может быть определен по соотношению 260:280, поэтому примеси белков в растворах нуклеиновых кислот вносят незначительную погрешность в определение концентрации ДНК и РНК.

Другие загрязнения

  • Загрязнения фенолом, который часто используют при выделении нуклеиновых кислот, может приводить к значительным погрешностям при измерении концентрации нуклеиновых кислот. Фенол имеет максимальное поглощение на длине волны 270 нм и соотношение A260/280 около 1.2. Нуклеиновые кислоты, не содержащие фенол, имеют соотношение A260/280 около 2.[1] Примеси фенола могут значительно завысить концентрацию ДНК.
  • Поглощение на длине волны 230 нм могут быть вызваны загрязнениями фенолятами, тиоцианатами и другими органическими соединениями. Для чистого образца РНК отношение A260/230 должно быть около 2, для чистого образца ДНК A260/230 около 1,8.[6]
  • Поглощение на длине волны 330 нм и выше указывает на другие загрязнения раствора. Поглощение на этих длинах волн для чистых препаратов нуклеиновых кислот должно быть равно нулю.
  • Отрицательные значения могут быть вызваны неверным выбором раствора, использованного в качестве пустого (blank). Также отрицательные значения могут быть следствием наличия флюоресцентного красителя в растворе.

Определение количества молекул ДНК или РНК с конкретными последовательностями нуклеотидов с помощью технологии SlipChip

Для диагностических целей часто надо определить количество той или иной ДНК или РНК. Разработаны высокочувствительные методы определения ДНК и РНК в микрообъёмах образцов — каплях не превышающих несколько пиколитров. Для этого используются микрожидкостные устройства для ПЦР с одной копии нуклеиновой кислоты[7][8][9][10]

Примечания

  1. 1 2 3 4 Sambrook and Russell. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. — 3rd. — Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. — ISBN 978-087969577-4.
  2. ↑ Tataurov A.V.; You Y., Owczarzy R. (2008). “Predicting ultraviolet spectrum of single stranded and double stranded deoxyribonucleic acids”. Biophys. Chem. 133 (1–3): 66—70. DOI:10.1016/j.bpc.2007.12.004. PMID 18201813. Используется устаревший параметр |coauthors= (справка)
  3. ↑ Kartha, R. Spectrophotometric Quantification of Nano- and Standard-Volume Samples, (2008, October 7), American Biotechnology Laboratory, http://www.iscpubs.com/Media/PublishingTitles/b0608kar.pdf
  4. ↑ Sambrook and Russell cites the original paper: Warburg, O. and Christian W. (1942). “Isolierung und Kristallisation des Gärungsferments Enolase”. Biochem. Z. 310: 384—421.)
  5. ↑ Glasel J. (1995). “Validity of nucleic acid purities monitored by 260nm/280nm absorbance ratios”. BioTechniques. 18 (1): 62—63. PMID 7702855.)
  6. ↑ The Analysis of DNA or RNA using Its Wavelengths: 230 nm, 260 nm, 280 nm. Bioteachnology.com (13 января 2010). Проверено 12 марта 2010. Архивировано 6 сентября 2012 года.
  7. ↑ Shen, F., Du, W., Kreutz, J. E., Fok, A., & Ismagilov, R. F. (2010). Digital PCR on a SlipChip]. Lab on a Chip, 10(20), 2666—2672. DOI:10.1039/c004521g PMC 2948063
  8. ↑ Jesus Rodriguez-Manzano, Mikhail A. Karymov, Stefano Begolo, David A. Selck, Dmitriy V. Zhukov, Erik Jue, Rustem F. Ismagilov. Reading Out Single-Molecule Digital RNA and DNA Isothermal Amplification in Nanoliter Volumes with Unmodified Camera Phones. ACS Nano, 2016; DOI:10.1021/acsnano.5b0733
  9. ↑ Ahrberg, C. D., Ilic, B. R., Manz, A., & Neužil, P. (2016). Handheld real-time PCR device.Lab on a Chip., 16, 586—592 DOI:10.1039/C5LC01415H PMID 26753557 PMC 4773913Available on 2017-01-26
  10. ↑ Zhao Li, Yong Liu, Qingquan Wei, Yuanjie Liu, Wenwen Liu, Xuelian Zhang, and Yude Yu1 (2016). Picoliter Well Array Chip-Based Digital Recombinase Polymerase Amplification for Absolute Quantification of Nucleic Acids. PLoS One.; 11(4): e0153359 DOI:10.1371/journal.pone.0153359 PMC 4830604

Данная страница на сайте WikiSort.ru содержит текст со страницы сайта "Википедия".

Если Вы хотите её отредактировать, то можете сделать это на странице редактирования в Википедии.

Если сделанные Вами правки не будут кем-нибудь удалены, то через несколько дней они появятся на сайте WikiSort.ru .



Текст в блоке "Читать" взят с сайта "Википедия" и доступен по лицензии Creative Commons Attribution-ShareAlike; в отдельных случаях могут действовать дополнительные условия.

Другой контент может иметь иную лицензию. Перед использованием материалов сайта WikiSort.ru внимательно изучите правила лицензирования конкретных элементов наполнения сайта.

2019-2024
WikiSort.ru - проект по пересортировке и дополнению контента Википедии