Двугибридный анализ — молекулярно-биологический метод для исследования белок-белковых и ДНК-белковых взаимодействий.
В статье[1] , опубликованной в 1989 году, впервые был описан новый метод для обнаружения белок-белковых взаимодействий с помощью активатора транскрипции GAL4 в дрожжах Saccharomyces cerevisiae. Однако, ещё за 2 года до этого был нарисован первый набросок, описывающий идею практического применения разделения ДНК связывающего и активационного доменов белка GAL4[2]. С тех пор данный метод активно развивался и адаптировался. С помощью него стало возможно исследовать не только пары белков, но и мульти-белковые комплексы и белково-нуклеотидные взаимодействия. Помимо Saccharomyces cerevisiae стало возможным использовать Escherichia coli.[3]
Базовый компонент дрожжевой двугибридной системы это активатор транскрипции GAL4, эндогенно экспрессируемый белок длиной в 881 а.о. Содержит ДНК-связывающий (1-147 а.о.) и активирующий (771—881 а.о.) домены. Для проверки взаимодействия между белком А и Б делают химеры А-ДНК-связывающий домен (СД) и Б-активирующий домен (АД). В составе химерных белков домены сохраняют свои функции. Находясь в непосредственной близости, возможно обусловленной взаимодействием между белками А и Б, воссоздается исходная функция белка GAL4, и происходит активация репортерного гена.[4]
При дрожжевом двугибрином скрининге часто используются генетически модифицированные штаммы дрожжей, в которых биосинтез некоторых питательных веществ (как правило, аминокислот или нуклеиновых кислот) отсутствует. При выращивании на средах, где не хватает этих питательных веществ, дрожжи не в состоянии выжить. В мутантный штамм дрожжей вводится чужеродная ДНК в форме плазмиды. Как правило, плазмиды, кодирующие АД- и СД- химерные белки вводятся в клетку раздельно. Чаще всего, слитый с СД белок является заранее известным белком, к которому ищется потенциально новый партнер, и плазмида, кодирующая данный химерный белок, изначально вводится во все клетки. Слитый с АД белок является либо единичным белком, либо целой библиотекой возможных партнеров, которая может быть представлена всеми белками, экспрессируемыми в конкретном организме, или же может быть получена путём синтеза случайных последовательностей ДНК. Независимо от источника, будет получен набор плазмид, которые позже будут трансфицированы в клетки. Методы с использованием библиотеки предполагают попадание всего одной пары плазмид в исследуемую клетку, тем самым каждая клетка выражает не более одного белка из библиотеки.[3]
При успешном взаимодействии А и Б, АД и СД факторы становятся опосредованно связаны, и АД оказывается в непосредственной близости от сайта начала транскрипции репортерного гена. При отсутствии взаимодействия нет и транскрипции. Следовательно, успешное взаимодействие связано с изменением клеточного фенотипа.[4]
Одногибридная система представляет собой способ для идентификации ДНК-белковых взаимодействий. АД заранее связан с СД, однако участок для посадки СД является случайным набором нуклеотидов. Кроме того, СД может быть представлен библиотекой ДНК-связывающих доменов. Если ДНК-связывающий домен взаимодействует с потенциальным участком связывания целевой ДНК, то АД будет активировать транскрипцию репортерных генов. Выбор ДНК-связывающих доменов, не ограничивается использованием одногибридной системы, и может быть выполнен с использованием двугибридной системы, в которой ДНК-связывающий домен различен, а А, Б белки и АД постоянны.[4]
Исследование РНК-белковых взаимодействий привело к появлению «тригибридных систем». В данной системе белки А и Б являются РНК-связывающими белками и вовсе не обязаны взаимодействовать между собой. Молекулы РНК используются в качестве линкера РНК-связывающих белков или доменов, тем самым обеспечивая близость активационного и ДНК-связывающего доменов.[4]
Так же прогрессивные исследования породили новый «одно-дву-гибридный» подход для скрининга библиотек для выявления новых факторов транскрипции. Одновременное использование одногибридной и двугибридной системы увеличивает точность получаемых результатов, и уменьшит количество ложных срабатываний[4].
В принципе, любая живая клетка может быть использована для двугибридой системы, однако имеются практические соображения о дешевизне и устойчивости выбранной клеточной линии.[5]
Исторически первым для двугибридной системы организмом являются дрожжи. Дрожжи стабильный, простой и хорошо изученный модельный организм. Дрожжевые клетки поддерживают нейтральные значения pH внутри клетки, несмотря на кислые pH во внешней среде. Также дрожжи слабочувствительны к внеклеточным токсинам, ими можно манипулировать, не используя молекулярных методов.[4] Важно отметить необходимость сигналов ядерной локализации, так как весь генетический аппарат дрожжей локализован в ядре. При их отсутствии потенциально взаимодействующая пара белков не будет транслирована и не провзаимодействует.
Бактериальные системы могут быть использованы аналогично дрожжевым. Они имеют заведомо больший потенциал и являются более предпочтительными для использования двугибридной системы. Бактериальные системы позволяют использовать и анализировать библиотеки размером больше 108, имеют более быстрый темп роста и больший потенциал для проницаемости небольших молекул. Так же отсутствует необходимость в сигналах ядерной локализации, и появляется возможность изучать белки, токсичные для дрожжей. Ввиду более быстрых селективных методов обеспечивается низкий уровень ложных результатов (3·10−8)[5]
При исследовании взаимодействия белков, возможно выявление новых функций. С помощью одного известного белка А0, библиотеки неизвестных белков Вn, и последующего сравнения с предварительно известной парой взаимодействующих белков A0B0 можно получить информацию о схожести Bn и B0. Похожие данные можно получить путём исследования взаимодействий известной библиотеки белков с одним белком с неизвестной функцией.[4]
Одна из наиболее популярных областей применения двугибридной системы. У заранее известной и взаимодействующей пары белков зачастую необходимо определить аминокислотные остатки, формирующие данное взаимодействие. При формировании библиотеки с точечными изменении аминокислотных остатков и использованием двугибридной системы появляется возможность определить их важность для взаимодействия с белком-партнером.[4]
При создании лекарств часто возникает проблема побочных эффектов. Двугибридная система может использоваться для тестирования специфичности и точности доставки лекарств. Аналогичный подход используется и для токсинов и ядов.[4]
Для выбора цинковых пальцев (ZPF) с успехом применяется метод двугибридного анализа[3]. Основой подхода является создание библиотеки случайных ZPF (случайное изменение определенных аминокислотных остатков) и выбор тех, которые осуществляют связывание с UAS областью. Каждый ZFP обычно распознает только 3-4 пары оснований, поэтому для точного, локального связывания используется система из заранее известных ZPF, которые связываются по краям необходимой области и предотвращают связывание вне UAS.[3]
Основным и почти единственным недостатком является возможность большого количества ложных положительных и ложных отрицательных результатов. Существует большое количество причин, которые могут вызвать неспецифическое связывание или, наоборот, подавить экспрессию. Вероятность получения ложных результатов означает, что все полученные данные должны быть подтверждены более точными методами анализа, например коиммунопреципитацией белков. Так же возможно использование нескольких двугибридных систем или параллельный биоинформатический анализ.
|deadlink= (справка)Данная страница на сайте WikiSort.ru содержит текст со страницы сайта "Википедия".
Если Вы хотите её отредактировать, то можете сделать это на странице редактирования в Википедии.
Если сделанные Вами правки не будут кем-нибудь удалены, то через несколько дней они появятся на сайте WikiSort.ru .