WikiSort.ru - Не сортированное

ПОИСК ПО САЙТУ | о проекте
TEV-протеаза
Идентификаторы
Шифр КФ 3.4.22.44
Номер CAS 139946-51-3
Базы ферментов
IntEnz IntEnz view
BRENDA BRENDA entry
ExPASy NiceZyme view
MetaCyc metabolic pathway
KEGG KEGG entry
PRIAM profile
PDB structures RCSB PDB PDBe PDBj PDBsum
Поиск
PMC статьи
PubMed статьи
NCBI NCBI proteins
CAS 139946-51-3

Протеаза TEV (от англ. Tobacco Etch Virus — вирус гравировки табака) — высокоспецифичная цистеиновая протеаза вируса гравировки табака. Относится к суперсемейству PA из химотрипсин-подобных протеаз. Благодаря своей высокой специфичности к последовательности часто используется для контролируемого расщепления гибридных белков in vitro и in vivo.[1]

Происхождение

Весь геном вируса гравировки табака кодирует единственный массивный полипротеин (350 кДа), который расщепляется на функциональные блоки тремя протеазами: Р1-протеазой (1 сайт расщепления), HC-Pro (1 сайт расщепления) и TEV-протеазой (7 сайтов расщепления).[2] Нативная протеаза также содержит внутренний участок саморасщепления. Этот участок медленно расщепляется, чтобы инактивировать фермент (физиологическая причина этого неизвестна).

Структура и функции

Структура TEV-протеазы. Два β-цилиндра, которые присущи надсемейству, выделены красным цветом. (PDB 1lvm)

Структура TEV-протеазы была определена с помощью рентгеновской кристаллографии.[3] Фермент состоит из двух β-цилиндров и гибкого C-конца, что показывает структурную гомологию с суперсемейством трипсиновых протеиназ (PA-клан,  семейство С4 по классификации MEROPS).[4] Несмотря на гомологию с  сериновыми протеазами (такими как трипсин, эластаза, тромбин и т. д.), в протеазе TEV используется цистеин в качестве каталитического центра[5] (как и во многих других вирусных протеазах).

Ковалентный катализ происходит с помощью триады Asp-His-Cys, разделенной между двумя β-цилиндрамим (Asp находится на β1, а His и Cys на β2).[6] Субстрат удерживается в виде β-листа, образуя антипараллельное взаимодействие с бороздкой между двумя цилиндрами и параллельное взаимодействие с C-концом.[7] Таким образом, фермент образует связывающий туннель вокруг субстрата, а взаимодействия боковой цепи обеспечивают специфичность.[3]

Специфичность

Модель поверхности TEV-протеазы, связанной с нерасщёплённым субстратом (черный), также показана каталитичесая триада (красный). Субстрат связывается в активном центре тоннеля (слева). В разрезе (справа) показана комплиментарная субстрату форма связывающего тоннеля. (PDB 1lvb)

Естественная последовательность расщепления была сначала определена путем изучения участков разрезания в нативном полипротеиновом субстрате для повторяющейся последовательности. Консенсусной последовательностью нативного сайта расщепления является ENLYFQ\S (где ‘\’ обозначает расщепляемую пептидную связь).[8] Аминокислотные остатки субстрата нумеруются с Р6 по Р1 до сайта расщепления и Р1’ после вырезанного участка. В ранних работах также проводили оценку расщепления массива схожих субстратов, чтобы определить насколько специфично фермент будет расщеплять нативную последовательность.[9][10]

В исследованиях впоследствии применялось секвенирование расщепляемых субстратов из пула рандомизированных последовательностей для определения предпочтительных паттернов.[11][12] Хотя ENLYFQ\S — это оптимальная последовательность, протеаза активна в большей или меньшей степени на различных субстратах (т. е. проявляет некоторую вариабельность). Наиболее эффективное расщепление происходит в последовательностях наиболее похожих на консенсус EXLYΦQ\φ, где X - любой аминокислотный остаток, Φ - любой большой или  гидрофобный остаток среднего размера, а φ - любой небольшой гидрофобный или полярный аминоктслотный остаток.

Специфичность обеспечивается большой площадью контакта между ферментом и субстратом. Протеазы, такие как трипсин,  специфичны для одного аминокислотного остатка до и после расщепляемой связи за счет мелкой связывающей щели только с одним или двумя карманами, которые связывают боковые цепи субстрата. И наоборот, вирусные протеазы, такие как TEV-протеаза, имеют длинный C-концевой хвост, который полностью закрывает субстрат для создания связывающего тоннеля. Этот туннель содержит набор связывающих карманов, так что каждая боковая цепь пептидного субстрата (с Р6 до Р1’) связывается с комплиментарным сайтом (с С6 до С1’).[3]

В частности, пептидная боковая цепь P6-Glu контактирует с сетью из трех водородных связей; P5-Asn указывает на растворитель, не создавая специфичных взаимодействий (по этой причине отсутствует консенсус в последовательности субстрата в данном положении); P4-Leu погружает в гидрофобный карман; P3-Tyr удерживает в гидрофобном кармане с короткой водородной связью в конце; P2-Phe также окружен гидрофобнымими остатками, включая поверхность триады гистидина; P1-Gln образует четыре водородные связи; и P1'-Ser только частично заключен в мелкую гидрофобную канавку.[3]

В качестве биохимического инструмента

Одним из основных направлений использования этого фермента является удаление афинных тагов из препаратов очищенного гибридного белка. Причиной использования TEV-протеазы в качестве биохимического инструмента является его высокая специфичность к последовательности. Это делает его относительно нетоксичным in vivo, поскольку узнаваемая им последовательность почти не встречается в белках.[13]

Хотя рациональное конструирование имело ограниченный успех в изменении специфичности протеазы, направленная эволюция использовалась для смены предпочтительного остатка до[14] либо после[15][16] сайта расщепления.

TEV-протеаза имеет ограничения в использовании. Она склонна к дезактивации путем саморасщепления, хотя этого можно избежаь путём мутации S219V во внутреннем сайте разрезания[17]. Протеаза экспрессированная в одиночку плохо растворма;  было сделано несколько попыток для улучшения её растворимости путем направленной эволюции и компьютерного моделирования. Кроме того, было показано, что экспрессия может быть улучшена путем слияния с мальтоза-связывающим белком, который повышает растворимость партнера.

Молекулярная масса этого фермента лежит в пределах от 25 до 27 кДа в зависимости от того, какая конструкция используются.

Внешние ссылки

Ссылки

  1. ↑ Kapust RB, Waugh DS (July 2000). “Controlled intracellular processing of fusion proteins by TEV protease”. Protein Expr. Purif. 19 (2): 312—8. DOI:10.1006/prep.2000.1251. PMID 10873547.
  2. ↑ UniProt: TEV polyprotein: P04517.
  3. 1 2 3 4 Phan J, Zdanov A, Evdokimov AG, Tropea JE, Peters HK, Kapust RB, Li M, Wlodawer A, Waugh DS (December 2002). “Structural basis for the substrate specificity of tobacco etch virus protease”. J. Biol. Chem. 277 (52): 50564—72. DOI:10.1074/jbc.M207224200. PMID 12377789.
  4. ↑ Rawlings ND, Barrett AJ, Bateman A (January 2012). “MEROPS: the database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors”. Nucleic Acids Res. 40 (Database issue): D343—50. DOI:10.1093/nar/gkr987. PMC 3245014. PMID 22086950.
  5. ↑ Bazan JF, Fletterick RJ (November 1988). “Viral cysteine proteases are homologous to the trypsin-like family of serine proteases: structural and functional implications”. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (21): 7872—6. Bibcode:1988PNAS...85.7872B. DOI:10.1073/pnas.85.21.7872. PMC 282299. PMID 3186696.
  6. ↑ Dougherty WG, Parks TD, Cary SM, Bazan JF, Fletterick RJ (September 1989). “Characterization of the catalytic residues of the tobacco etch virus 49-kDa proteinase”. Virology. 172 (1): 302—10. DOI:10.1016/0042-6822(89)90132-3. PMID 2475971.
  7. ↑ Tyndall JD, Nall T, Fairlie DP (March 2005). “Proteases universally recognize beta strands in their active sites”. Chem. Rev. 105 (3): 973—99. DOI:10.1021/cr040669e. PMID 15755082.
  8. ↑ Carrington JC, Dougherty WG (May 1988). “A viral cleavage site cassette: identification of amino acid sequences required for tobacco etch virus polyprotein processing”. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (10): 3391—5. Bibcode:1988PNAS...85.3391C. DOI:10.1073/pnas.85.10.3391. PMC 280215. PMID 3285343.
  9. ↑ Dougherty WG, Cary SM, Parks TD (August 1989). “Molecular genetic analysis of a plant virus polyprotein cleavage site: a model”. Virology. 171 (2): 356—64. DOI:10.1016/0042-6822(89)90603-X. PMID 2669323.
  10. ↑ Kapust RB, Tözsér J, Copeland TD, Waugh DS (June 2002). “The P1' specificity of tobacco etch virus protease”. Biochem. Biophys. Res. Commun. 294 (5): 949—55. DOI:10.1016/S0006-291X(02)00574-0. PMID 12074568.
  11. ↑ Boulware KT, Jabaiah A, Daugherty PS (June 2010). “Evolutionary optimization of peptide substrates for proteases that exhibit rapid hydrolysis kinetics”. Biotechnol. Bioeng. 106 (3): 339—46. DOI:10.1002/bit.22693. PMID 20148412.
  12. ↑ Kostallas G, Löfdahl PÅ, Samuelson P (2011). “Substrate profiling of tobacco etch virus protease using a novel fluorescence-assisted whole-cell assay”. PLoS ONE. 6 (1): e16136. DOI:10.1371/journal.pone.0016136. PMC 3022733. PMID 21267463.
  13. ↑ Parks TD, Leuther KK, Howard ED, Johnston SA, Dougherty WG (February 1994). “Release of proteins and peptides from fusion proteins using a recombinant plant virus proteinase”. Anal. Biochem. 216 (2): 413—7. DOI:10.1006/abio.1994.1060. PMID 8179197.
  14. ↑ “Engineering of TEV protease variants by yeast ER sequestration screening (YESS) of combinatorial libraries”. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (18): 7229—34. April 2013. DOI:10.1073/pnas.1215994110. PMID 23589865.
  15. ↑ “A tobacco etch virus protease with increased substrate tolerance at the P1' position”. PLoS ONE. 8 (6): e67915. 2013. DOI:10.1371/journal.pone.0067915. PMID 23826349.
  16. ↑ “Intracellular detection and evolution of site-specific proteases using a genetic selection system”. Appl. Biochem. Biotechnol. 166 (5): 1340—54. March 2012. DOI:10.1007/s12010-011-9522-6. PMID 22270548.
  17. ↑ Kapust RB, Tözsér J, Fox JD, Anderson DE, Cherry S, Copeland TD, Waugh DS (December 2001). “Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency”. Protein Eng. 14 (12): 993—1000. DOI:10.1093/protein/14.12.993. PMID 11809930.

Данная страница на сайте WikiSort.ru содержит текст со страницы сайта "Википедия".

Если Вы хотите её отредактировать, то можете сделать это на странице редактирования в Википедии.

Если сделанные Вами правки не будут кем-нибудь удалены, то через несколько дней они появятся на сайте WikiSort.ru .



Текст в блоке "Читать" взят с сайта "Википедия" и доступен по лицензии Creative Commons Attribution-ShareAlike; в отдельных случаях могут действовать дополнительные условия.

Другой контент может иметь иную лицензию. Перед использованием материалов сайта WikiSort.ru внимательно изучите правила лицензирования конкретных элементов наполнения сайта.

2019-2025
WikiSort.ru - проект по пересортировке и дополнению контента Википедии